√Ћј¬Ќјя  ќЌ“ј “џ
 
—»—“≈ћј ѕќЋ≈«Ќќ√ќ ѕ»“јЌ»я
ѕ–ќ“»¬ќћ» –ќЅЌџ≈ јѕѕј–ј“џ "Ѕ»ќ‘ќЌ"
‘ќ“ќЌЌџ… ¬≈Ќ“»Ћя“ќ– ЂЁ¬–» ї
ћј—Ћќ“≈–јѕ»я
√»√»≈Ќј
Ё ќЋќ√»я
‘»«»„≈— »≈ Ќј√–”« »
ƒџ’јЌ»≈
ѕ—»’ќЋќ√»я «ƒќ–ќ¬№я
ћ≈ƒ»“ј÷»я
¬»“јћ»Ќџ » ¬»“јћ»Ќќ“≈–јѕ»я
ѕ–ќ‘»Ћј “» ј
—ќ¬–≈ћ≈ЌЌјя ћ≈ƒ»÷»Ќј
ƒ≈ѕќЋя–»«ј÷»ќЌЌјя “≈–јѕ»я
„ј≈“≈–јѕ»я
 ќ‘≈“≈–јѕ»я
¬»Ќќ“≈–јѕ»я
Ѕ»ќЋќ ј÷»я
Ќќ¬ќ—“»
¬ќѕ–ќ—-ќ“¬≈“
ќЅ–ј“Ќјя —¬я«№
ѕќ»— 

√Ћ”Ѕќ ќ”¬ј∆ј≈ћџ… ћ» –ќЅ
√Ћ”Ѕќ ќ”¬ј∆ј≈ћџ… ћ» –ќЅ
¬алерий ѕоройко, к.б.н.
”ниверситет „икаго, ƒепартамент общей хирургии

   —о времен ѕастера известно, что желудочно-кишечный тракт человека, по существу, €вл€етс€ биореактором проточного типа, в котором обитает множество микроорганизмов. ќтношение ученых к микрофлоре кишечника за это врем€ радикально изменилось. Ћет сто назад великий »ль€ ћечников, основоположник современной теории иммунитета, за создание которой он получил Ќобелевскую премию (на двоих со своим непримиримым оппонентом, не менее великим ѕаулем Ёрлихом), предлагал даже удаление толстого кишечника как один из способов продлени€ жизни. ј тем, кому эта мера казалась слишком радикальной, рекомендовал пить как можно больше кефира, чтобы вытеснить вредных, по его мнению, микробов полезными лактобактери€ми. „ерез полвека курс изменилс€ на 180 градусов. ќказалось, что нормальна€ микрофлора кишечника, а также кожи и слизистых оболочек, выполн€ет множество полезных функций Ч например, подавл€ет жизнеде€тельность посто€нно атакующих организм патогенных микроорганизмов. ј в последние годы самые смелые из микробиологов пошли еще дальше, объ€вив человека и его микробов единым симбиотическим сверхорганизмом.
   –азвитие методов молекул€рной биологии вывело ученых на новый уровень понимани€ процессов симбиоза человека и его микрофлоры, которые казались хорошо изученными и от изучени€ которых не ждали особых сюрпризов. —тремительный рост скорости и падение стоимости методов секвенировани€ ƒЌ  (определени€ еЄ нуклеотидной последовательности) и параллельный рост мощности персональных компьютеров и развитие »нтернета дали возможность анализировать информацию о крупных участках геномов. ѕосле того, как были расшифрованы хромосомы сотен видов отдельных бактерий, в генетике микроорганизмов по€вилс€ новый подход Ч попул€ционный: анализ генов сразу всех бактерий, насел€ющих определенный ареал. –азумеетс€, население "человеческого биореактора" оказалось одной из наиболее важных дл€ изучени€ микробных попул€ций.
   ѕерва€ работа, заставивша€ по-новому взгл€нуть на кишечную микробиоту, была опубликована в 1999 году группой ученых из Ќационального института агрономических исследований (‘ранци€) и ”ниверситета –идинга (¬еликобритани€). јвторы решили применить дл€ исследовани€ микробной попул€ции кишечника метод секвенировани€ генов 16S –Ќ .

16S –Ќ  Ч удостоверение личности бактерии

   —о времен ѕастера первым и необходимым этапом определени€ микроорганизмов было их культивирование на питательных средах. Ќо множество важных (и полезных, и патогенных) микробов не желают расти ни на одной из сред. »зучать ранее недоступные некультивируемые бактерии и начать наводить пор€док в донельз€ запутанной систематике уже известных прокариот стало возможным с развитием биоинформатики и по€влением современных методов молекул€рной биологии Ч полимеразной цепной реакции (ѕ÷–), позвол€ющей из одного участка ƒЌ  получить миллионы и миллиарды точных копий, клонировани€ выделенных с помощью ѕ÷– генов в бактериальных плазмидах и методик секвенировани€ последовательностей нуклеотидов, полученных в результате всего этого в достаточном дл€ анализа количестве.
   »деальным маркером дл€ идентификации микроорганизмов оказалс€ ген, кодирующий 16S рибосомальную –Ќ  (кажда€ из двух субъединиц рибосом Ч клеточных мастерских по синтезу белка Ч состоит из переплетенных молекул белков и цепочек рибонуклеиновых кислот).
   Ётот ген есть в геноме всех известных бактерий и архей, но отсутствует у эукариот и вирусов, и если вы нашли характерную дл€ него последовательность нуклеотидов Ч вы точно имеете дело с генами прокариот. (≈сли быть очень точным, ген 16S –Ќ  есть и у эукариот, но не в €дерных хромосомах, а в митохондриальных. Ёто еще раз подтверждает, что митохондрии Ч отдаленные потомки бактерий-симбионтов первых эукариотических организмов.)
   Ётот ген имеет как консервативные участки, одинаковые у всех прокариот, так и видоспецифичные.  онсервативные участки служат дл€ первого этапа полимеразной цепной реакции Ч присоединени€ исследуемой ƒЌ  к праймерам (затравочным участкам ƒЌ , к которым изучаема€ цепочка нуклеотидов должна присоединитьс€ дл€ начала анализа остальной последовательности), а видоспецифичные Ч дл€ определени€ видов.   тому же степень схожести видоспецифичных участков очень хорошо отражает эволюционное родство разных видов.

   ƒополнительный бонус Ч дл€ клонировани€ и последующего анализа можно использовать саму рибосомальную –Ќ , котора€ в любой клетке присутствует в гораздо большем количестве, чем соответствующий ей ген. “олько надо сначала "переписать" еЄ в ƒЌ  с помощью специального фермента Ч обратной транскриптазы.
   Ќуклеотидные последовательности 16S –Ќ  всех известных бактерий и архей (около 10 000 видов) общедоступны. ¬ы€вленные последовательности сравнивают с имеющимис€ в базах данных и точно идентифицируют вид бактерии или объ€вл€ют еЄ принадлежащей к очередному некультивируемому виду.
   ¬ последнее врем€ идет интенсивный пересмотр старой, фенотипической, классификации бактерий, основанной на плохо формализуемых критери€х Ч от внешнего вида колоний до пищевых предпочтений и способности окрашиватьс€ разными красител€ми. Ќова€ систематика опираетс€ на молекул€рные критерии (16S –Ќ ) и только отчасти повтор€ет фенотипическую.
    одирующие последовательности 16S –Ќ  с помощью ѕ÷– извлекали непосредственно из "окружающей среды" Ч 125 миллиграммов человеческого, извините, стула, встраивали в плазмиды кишечной палочки (не потому, что она кишечна€, а потому, что Escherichia coli Ч одна из любимых рабочих лошадок молекул€рных биологов) и снова выдел€ли из культуры размножившихс€ бактерий. “аким образом была создана библиотека генов 16S –Ќ  всех микроорганизмов, находившихс€ в образце. ѕосле этого случайным образом было отобрано и секвенировано 284 клона. ќказалось, что только 24% полученных последовательностей 16S –Ќ  принадлежали известным ранее микроорганизмам. “ри четверти микрофлоры, наход€щейс€ в кишечнике каждого человека, больше сотни лет избегали внимани€ исследователей, вооруженных методами классической микробиологии! ”ченые просто не могли подобрать услови€ дл€ культивировани€ этих бактерий, потому что самые капризные обитатели кишечника отказывались расти на традиционных микробиологических средах.
   Ќа сегодн€шний день при помощи молекул€рных методов установлено, что в микробиоте взрослого человека представлены 10 из 70 крупных бактериальных таксонов. ќколо 90% наших микробов принадлежат к типам Firmicutes (к ним относ€тс€, например, всем известные лактобактерии Ч основные "виновники" скисани€ молока) и Bacteroidetes Ч облигатные анаэробы (организмы, способные жить только в отсутствие кислорода), которые часто используютс€ в качестве индикатора загр€знени€ природных вод канализационными стоками. ќставшиес€ 10% попул€ции поделено между таксонами Proteobacteria (к ним относитс€, среди прочих, и кишечна€ палочка), Actinobacteria (из одного из видов актиномицетов был выделен антибиотик стрептомицин), Fusobacteria (обычные обитатели ротовой полости и часта€ причина пародонтоза), Verrucomicrobia (недавно в геотермальном источнике был обнаружен вид этих микробов, питающихс€ метаном, которого в кишечнике предостаточно благодар€ жизнеде€тельности других микроорганизмов), Cyanobacteria (их до сих пор часто называют старым названием "сине-зеленые водоросли"), Spirochaeates (по счастью, не бледные), Synergistes и VadinBE97 (что это за звери, спросите у создателей новой систематики прокариот).
   Ќесмотр€ на то, что видовой состав микроорганизмов кишечника достаточно однообразен, количественное соотношение представителей определенных систематических групп в микробиоте разных людей может сильно варьировать. Ќо что же представл€ет из себ€ нормальна€ кишечна€ микрофлора и каковы пути еЄ формировани€?
   Ќа этот вопрос был дан ответ в опубликованной в 2007 году работе группы американских биологов под руководством ѕатрика Ѕрауна из —тэнфордского университета. ќни проследили формирование микробиоты у 14 новорожденных младенцев на прот€жении первого года жизни. јвторам удалось установить несколько источников колонизации желудочно-кишечного тракта. ћикробиота младенцев имела сходство с микрофлорой матери: вагинальной, фекальной или с микрофлорой образцов грудного молока. ¬ зависимости от источников колонизации, в микрофлоре кишечника младенцев на прот€жении первого года жизни преобладали различные виды. Ёти различи€ оставались значительными на прот€жении всего периода исследовани€, однако к годовалому возрасту становились заметны черты формировани€ взрослой микробиоты. »нтересные данные были получены на примере пары близнецов. ћикрофлора у них была практически идентичной по составу и мен€лась тоже одинаково. Ёта находка вы€вила огромную роль человеческой составл€ющей пары микробиота-хоз€ин в формировании попул€ции кишечной микрофлоры. ƒл€ чистоты эксперимента, конечно, следовало бы разлучить младенцев еще в роддоме Ч прекрасный сюжет дл€ индийского фильма! —пуст€ годы они узнают друг друга по анализу: Ќо данные других работ подтвердили предположение, что индивидуальные, в том числе наследственно обусловленные, особенности биохимии человека оказывают большое вли€ние на состав его микробиоты.

ћикробного в нас больше, чем человеческого

    роме изучени€ отдельных видов кишечной микрофлоры, в последние годы многие исследователи изучают бактериальный метагеном Ч совокупность генов всех микроорганизмов в пробе содержимого человеческого кишечника (или в смыве с кожи, или в пробе ила с морского дна). ƒл€ этого используют самые автоматизированные, компьютеризированные и высокопроизводительные технологии секвенировани€ ƒЌ , дающие возможность анализировать короткие последовательности нуклеотидов, собирать головоломку по нескольким совпадающим "буквам" на концах этих участков, многократно повтор€ть эту процедуру дл€ каждого кусочка генома и получать расшифровку отдельных генов и хромосом со скоростью до 14 миллионов нуклеотидов в час Ч на пор€дки быстрее, чем это делалось всего несколько лет назад. “ак было установлено, что микробиота человеческого кишечника насчитывает примерно 100 триллионов бактериальных клеток Ч примерно в 10 раз больше, чем общее число клеток тела хоз€ина. Ќабор генов, вход€щих в состав бактериального метагенома, примерно в 100 раз превышает набор генов человеческого организма. ≈сли говорить об объеме биохимических реакций, протекающих внутри микробной попул€ции, он оп€ть же многократно превышает таковой в организме человека. Ѕактериальный "реактор" реализует в организме хоз€ина метаболические цепочки, которые тот не способен поддерживать сам Ч например, синтез витаминов и их предшественников, разложение некоторых токсинов, разложение целлюлозы до усво€емых полисахаридов (у жвачных животных) и т.д.
   »сследовани€, проведенные в лаборатории ƒжефри √ордона (Ўкола медицины при ”ниверситете ¬ашингтона, —ент-Ћуис, ћиссури) позволили св€зать видовое разнообразие бактерий желудочно-кишечного тракта с диетой и особенност€ми обмена веществ индивидуума. –езультаты эксперимента опубликованы в декабрьском номере Nature за 2006 год. √одичный эксперимент предполагал установить коррел€цию между избытком веса у человека и составом микробной попул€ции его кишечника. ƒюжину толст€ков, согласившихс€ положить свои животы на алтарь науки, разделили на две группы. ќдна села на диету с низким содержанием жиров, втора€ Ч с низким содержанием углеводов. ¬се добровольцы худели, и одновременно у них мен€лось соотношение двух основных групп микроорганизмов кишечника: количество клеток Firmicutes снижалось, а количество Bacteroidetes, наоборот, росло. Ќа обезжиренной диете такое изменение становилось заметным позже Ч после того, как пациенты тер€ли 6% веса, а на низкоуглеводной Ч после потери первых килограммов (2% исходной массы тела). ѕри этом изменение состава микрофлоры было тем больше выражено, чем меньше становилс€ вес участников эксперимента.
   ѕараллельно в той же лаборатории проводились эксперименты на лабораторных мышах, несущих мутацию в гене лептина Ч "гормона сытости", белка, который синтезируетс€ в клетках жировой ткани и вкладывает свою лепту в формирование чувства насыщени€. ћыши, у которых повреждены обе копии этого гена (эта мутаци€ обозначаетс€ индексом Lepob), ед€т на 70% больше, чем дикий тип, со всеми вытекающими из этого последстви€ми. ј содержание Firmicutes в их кишечнике в полтора раза выше, чем у гетерозиготных линий, с только одной бракованной аллелью (ob/+), и гомозиготных по нормальному гену линий дикого типа (+/+).
   ¬ли€ние микрофлоры на обмен веществ еЄ "хоз€ина" исследователи проверили на ещЄ одной модели Ч гнотобиотических мышах.
   “аких животных, с момента рождени€ живущих в стерильных камерах и ни разу в жизни не встречавшихс€ ни с одним микробом, используют в биомедицинских исследовани€х не часто. јбсолютна€ стерильность в мышатнике, крольчатнике и тем более козьем хлеву Ч дело дорогое и хлопотное, а после встречи с первым же микробом или вирусом бедн€ги или умрут, или станут непригодными к дальнейшим экспериментам. „то происходит у гнотобиотов с иммунной системой Ч отдельна€ истори€, а ед€т они за троих и при этом Ч кожа да кости из-за отсутстви€ микробного компонента пищеварени€.
   ѕосле пересадки микрофлоры от тучных (ob/ob) доноров мыши-гнотобиоты за две недели растолстели почти в полтора раза (на 47%). “е, которых "засе€ли" микрофлорой от доноров дикого типа (+/+) с нормальным весом, поправились только на 27%.
   –езультаты дальнейшего изучени€ изменений симбиотического мышино-микробного организма блест€ще подтвердила гипотезу о том, что микробиота тучных индивидуумов способствует более глубокой переработке пищи. —равнение образцов ƒЌ  стула тучных и нормальных мышей показало, что микробиом тучных мышей насыщен генами ферментов, позвол€ющих более эффективно разлагать полисахариды.  ишечник тучных мышей содержал большие количества конечных продуктов ферментации Ч соединений уксусной и масл€ной кислот, что указывает на более глубокую переработку компонентов пищи.  алориметрический (от слова "калории"!) анализ образцов стула подтвердил это: стул ob/ob-мышей содержал меньшее число калорий, чем у мышей дикого типа, которые не так полно усваивали энергию из пищи.
   ѕомимо важной информации о "микробной" составл€ющей ожирени€, авторам удалось показать принципиальную схожесть микрофлор страдающих ожирением людей и мышей, что открывает новые перспективы в исследовании проблемы избыточного веса, а возможно Ч и разрешени€ этой проблемы путем "пересадки" здоровой микрофлоры или еЄ формировани€ у пациентов, страдающих ожирением.
   “о, что микробиота может управл€ть метаболизмом хоз€ина, уже не вызывает сомнени€. »сследовани€ лаборатории √ордона, посв€щенные проблеме излишнего веса, позволили перекинуть мостик к лечению метаболических заболеваний, таких как общее истощение, поражающее детей от года до четырех лет в бедных странах с тропическим климатом Ч маразмус (к маразму это слово имеет лишь лингвистическое отношение: греч. marasmos дословно означает истощение, угасание) и квашиоркор (на €зыке одного из племен √аны kwashiorkor Ч "красный мальчик"). ¬озникновение заболеваний св€зывают с недостатком белков и витаминов при переходе от грудного вскармливани€ на взрослую пищу. Ќо заболевани€ выборочно поражает детей, чьи брать€ и сестры не испытывали никаких проблем с переходом на традиционный дл€ данного региона рацион. »сследовани€ показали, что кишечна€ микрофлора больных детей разительно отличаетс€ от микрофлоры их родителей, а также от микрофлоры здоровых братьев и сестер. ѕрежде всего отмечалось практически полное отсутствие в кишечной попул€ции Bacteroidetes и доминирование редких видов, относ€щихс€ к типам Proteobacteria и Fusobacteria . ѕосле того, как больных детей (аккуратно, чтобы не передозировать!) откармливали усиленно-белковой пищей, их микробиота становилась похожей на нормальную, такую, как у родственников, с преобладанием Bacteroidetes и Firmicutes.
   »сследовани€ последних лет не только коренным образом изменили сложившиес€ представлени€ о кишечной микрофлоре человека, но и способствовали по€влению концепции, рассматривающей микробиоту кишечника как дополнительный многоклеточный "орган" организма человека. ќрган, состо€щий из различных линий клеток, способных общатьс€ как между собой, так и с организмом хоз€ина. ќрган, перераспредел€ющий энергетические потоки, осуществл€ющий важные физиологические реакции, измен€ющийс€ под воздействием среды и самовосстанавливающийс€ при изменени€х, вызванных внешними услови€ми.
   ѕродолжение исследовани€ "бактериального органа" может и должно привести к пониманию законов его функционировани€, раскрытию его тонких св€зей с организмом хоз€ина и, как следствие, к возникновению новых методов борьбы с болезн€ми человека путем целенаправленного лечени€ дисфункций обоих составл€ющих метаорганизма.

»нформаци€ с портала "¬ечна€ молодость" www.vechnayamolodost.ru